固定细胞扫SEM的实验过程和操作方法

固定细胞扫SEM的操作细节

我知道大概操作过程如下吧：

SEM（细胞粘附）实验方法：
1．细胞接种到材料上；
2．4,7,（3,5）天取样；
3．吸弃原有培养基；
4．加入1mLPBS培养基吹洗材料* 3次（长在材料表面的细胞不会掉）
5．吸弃PBS加入2.5-3.0% 戊二醛（固定2.5－3h）；
6．吸弃戊二醛,30%,50%,75%,80%,95%,100%(两次)梯度乙醇脱水（15min/次）；
7．在玻璃瓶中乙酸异戊酯（乙酸乙酯）替换（大于30min）；
8．临界点干燥后送扫描电镜观察。

请教：

1、PBS冲洗是指把PBS轻轻滴加在有细胞的材料表面？还是真的用吸管去冲洗？
2、戊二醛也是滴在上面还是把材料浸泡在戊二醛溶液里面？
3、乙醇也是轻轻滴加在上面？是一次脱水共计15min，还是每个浓度15min？
4、啥样的玻璃瓶比较好，玻璃培养皿行不？乙酸乙酯怎么替换啊？滴加还是浸泡？浓度多少呢？

PS:材料是薄膜状，平的，透明的

呵呵，谢谢啦，比较繁琐，偶第一次做，不太明白，谢谢各位啦
 

1、PBS冲洗是指把PBS轻轻滴加在有细胞的材料表面？还是真的用吸管去冲洗？
如果要防止细胞被冲走，可以沿培养板壁慢慢加入PBS; 当然你这里说取样点为4， 7天，应该没有这个问题。只是这个时间说短， 看不到细胞粘附；说长，还不到细胞分化；当然这和你使用什么细胞有关。

2、戊二醛也是滴在上面还是把材料浸泡在戊二醛溶液里面？
一般采用把样品浸泡在戊二醛里面；时间上一般细胞的话，1h足够了，时间紧半个小时亦可

3、乙醇也是轻轻滴加在上面？是一次脱水共计15min，还是每个浓度15min？
乙醇也是采用浸泡，脱水每个浓度10-20min,根据样品细胞来。

4、啥样的玻璃瓶比较好，玻璃培养皿行不？乙酸乙酯怎么替换啊？滴加还是浸泡？浓度多少呢？
一般的培养板或者培养皿都可；乙酸乙酯并不是每个人都用，大部分只要乙醇置换，CO2临界点干燥就是了。如果一定要用，应该还是浸泡；注意的地方是动作要快，100%乙醇挥发极快。

CO2临界点干燥需要什么仪器？没有这一步行吗，也就是说乙醇脱水后直接自然条件下干燥？

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我用酒精脱水后放冰箱，过一会就自己风干了，看文献上说风干是绝对不行的，那酒精和乙酸乙酯挥发的那么快，一下就干了，怎么去CO2干燥啊

先准备好一个带盖子玻璃容器（如用过的青霉素瓶），加入一定量乙酸异戊酯（要能泡住材料），从无水乙醇中取出你的材料后就放进去，盖好盖子，替换30min后就可以去临界点干燥了

如果没有二氧化碳临界点干燥器，还有别的什么干燥办法吗？冷冻干燥可以吗？

冷冻干燥没试过，不知会不会影响细胞形貌

可以试试，要把握好时间，把握得好影响不大